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细胞表面疏水性分析
2018-01-27 来源:北纳生物

<菌株>

摘要:实验结果表明,在外界溶剂压力的条件下,Spy表达量的提高,致使磷酸化的CpxR和BaeR能更有效地调控许多膜压力相关靶基因的转录;此外,研究报导Spy的过表达还可以提高胞内许多参与物质运输、辅助蛋白折叠的分子伴侣的活性。

在外源添加0.8% (V/V)丁醇的条件下,监测菌株的生长状况。图 5-A结果显示丁醇处理10 h后,敲除菌E. 对照组OD600为1.331,菌体量分别降低了8.41%和11.80%;nlpE和spy的敲除显著降低了菌株的丁醇耐受性;图 5-B结果显示E. coli JM109/pQE80L-spy在0.8% (V/V)的丁醇处理10 h后,细胞的生长速率以及总菌体量明显高于对照组E. coli JM109/pQE80L,最高OD600可达1.475,比对照组(OD6001.301)高13.37%,说明Spy的过表达有利于提高菌株对丁醇的耐受性。相反E. coli JM109/pQE80L-nlpE菌株最终OD600为1.198,比对照组低7.92%,NlpE的过表达则使得菌株在丁醇压力下处于相对生长劣势。另一方面,NlpE是细胞外膜感知蛋白,可参与某些溶剂结合并加大溶剂的摄入量,且过表达NlpE能够激活胞内编码AcrD、TolC和MdtABC等许多药物外排泵的表达,从而提高菌株的耐药性以及金属离子抗性。然而,AcrAB-TolC外排泵不参与短链醇类(如丁醇)的排出。因此,过表达NlpE对提高E. coli丁醇耐受性没有贡献。

当细胞受到外界刺激时,胞外信号分子首先与受体结合形成复合体,然后细胞膜上的腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)催化ATP脱去焦磷酸而生成cAMP。cAMP作为第二信使通过激活PKA (cAMP依赖性蛋白激酶)使靶细胞蛋白磷酸化,从而激活细胞应答反应。cAMP最终又被磷酸二酯酶水解成5′-AMP而失活。其中双组分系统中Cpx系统主要是由细胞内膜上的组氨酸激酶CpxA以及位于细胞质的响应调节蛋白CpxR组成。基于胞内第二信使分子对于蛋白激酶的作用,本实验尝试通过外部添加cAMP考察对重组菌株丁醇耐受性的影响。

比较图 5-B和图 6-A可知,在添加cAMP后,实验组和对照组菌体的生长速率以及菌体总量相对于不添加cAMP (图 5-B)来说都有显著的增加,菌株E. coli JM109/pQE80L-nlpE、E. coli JM109/pQE80L-spy和对照菌的OD600值由1.188、1.455和1.309分别增长到1.676、1.817和1.565。重组菌株E. coli JM109/pQE80L-nlpE菌株在添加cAMP条件下具有比对照菌更高的丁醇耐受性,推测可能是因为辅助感知蛋白NlpE在添加cAMP的条件下,对Cpx压力应答途径发挥正调控作用。重组菌株E. coli JM109/pQE80L-spy同样表现出了更好的丁醇耐受性,cAMP作为胞内第二信使分子能与cAMP receptor protein (CRP)形成复合物,参与胞内许多代谢过程的调控,CRP调节的多数基因可能会诱导激活δE和Cpx压力应答途径,调节耐受性相关基因的转录,从而提高细胞的丁醇耐受性。

为了进一步验证Cpx和Bae压力应答途径是否得到激活和过表达,我们选择了Cpx应答途径中的cpxR基因和Bae应答途径中的baeR基因,通过实时荧光定量PCR从转录水平上考察其表达量变化。结果如图 6-B所示,加入cAMP后,在NlpE重组菌株中cpxR和baeR基因的表达量分别提高了1.56和1.30倍;同时在Spy重组菌株中cpxR提高了约1.83倍,而baeR提高了约1.94倍。相比对照菌株cpxR和baeR基因的表达水平都有了很明显的提升。由此可知,cAMP的添加可以激活Cpx和Bae压力应答途径,提高系统中调节基因的表达水平。

研究重组菌株对不同溶剂的耐受性可对其机制有更全面的认识,更好地指导溶剂耐受菌在发酵和生物催化等方面的应用。因此选取了具有不同疏水性和极性的溶剂(甲苯、四氢呋喃、环己烷和乙酸丁酯),考察重组菌株对它们的耐受性规律。当菌株生长至OD600为0.8时,分别添加0.1% (V/V)甲苯、0.6% (V/V)四氢呋喃、0.6% (V/V)乙酸丁酯和0.6% (V/V)环己烷,并继续培养10 h,生长曲线如图 7。首先,对照菌株在上述溶剂条件下均几乎不能生长或者自溶,说明大肠杆菌本身不能耐受上述溶剂。过表达spy的菌株在甲苯、四氢呋喃和环己烷溶剂刺激下,其OD600可由初始的0.79分别增长到0.94、0.92和0.97,在乙酸丁酯中几乎不能生长。过表达nlpE的菌株在四氢呋喃、甲苯和环己烷溶剂刺激下,其OD600可由初始的0.80分别增长到0.83、0.92和0.87,与对照菌株相近,乙酸丁酯的加入导致细胞裂解,OD600下降。结果表明,重组菌株pQE80L-spy在对于甲苯、环己烷、四氢呋喃、丁醇四种有机溶剂的耐受性方面具有良好的遗传优势。Spy表达量的提高不仅提高胞内许多参与物质运输、辅助蛋白折叠的分子伴侣的活性,还激活了Bae以及Cpx双组分压力应答途径。为了抵抗有机溶剂对细胞的危害,受BaeR和CpxR调控的一系列编码能量代谢以及维持细胞膜稳定性的基因大量表达,从而缓解溶剂带来的生长压力。另一方面,NlpE的过表达提高了细胞对甲苯和环己烷的耐受性,相反对短链醇类(丁醇)的刺激却没有发挥出预想的作用。

细胞粘着碳烃化合物法(microbial adhesion to hydrocarbons,MATH)可以对细胞表面疏水性进行定性分析,有助于理解细胞溶剂耐受性的变化。采用MATH法分别测定了E。 coli JM109与E。 coli JM109/pQE80L-spy和E。 coli JM109/pQE80L-nlpE对丁醇、甲苯、乙酸丁酯和环己烷的粘附率(表 2)。相比对照菌株,Spy过表达导致细胞对丁醇和乙酸丁酯粘附率降低,而NlpE过表达导致细胞对这两种溶剂的粘附率增加。粘附率升高表明细胞表面与待测溶剂性质趋于相似,溶剂的吸附和摄入量增大,这与过表达NlpE导致细胞对丁醇和乙酸丁酯的耐受性降低的结果一致(图 5-B,图 7-A)。反之粘附率降低,导致溶剂的粘附和摄入降低,有助于降低丁醇的毒性,提高对丁醇的耐受性。Spy和NlpE重组菌株对环己烷和甲苯的粘附率均降低,表明重组菌株细胞对这两种溶剂的粘附能力降低,因而可在一定程度上缓解其对细胞的毒性,这与2。4中环己烷和甲苯对重组菌株生长影响的结果一致(图 7-B,图 7-C)。此外,四氢呋喃为亲水性溶剂,可充分溶解于缓冲液中,因而水相菌体浓度的监测难度较大,无法用MATH法准确测定其粘附率。综上,不同细胞对同一溶剂的粘附率越大,即细胞表面的疏水性越强,溶剂对细胞的毒害作用越大(耐受性低),反之则越小(耐受性高)。

本研究通过对大肠杆菌内压力应答途径的分析,结合丁醇对细胞毒害作用的机理,首次将大肠杆菌溶剂耐受性与信号响应途径联系起来,是对大肠杆菌溶剂耐受性机理的初步探索。Cpx和Bae压力应答途径在丁醇压力下发挥了重要作用,外源添加cAMP可以有效地激活胞内Cpx和Bae压力响应途径,提高系统中调节子的表达水平。通过对这2个压力应答途径的功能以及调控机制的探究,成功构建了Spy和NlpE重组菌株;其中Spy的过表达能有效地提高菌株对丁醇、甲苯、环己烷以及四氢呋喃的耐受性,NlpE表达水平的提高在对甲苯和环己烷的耐受性方面显示出了较好的优势。

来源:《微生物学报》

作者:吴安宁, 许国超, 韩瑞枝, 董晋军, 倪晔

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