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2⁃羟乙基醚诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞的实验部分

发布时间:2018-01-24 00:00 作者:北纳创联
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Thermo Fisher 3111 型 CO2 细胞培养箱,Ther⁃ mo Fisher HERAEUS FRESCO 21 型离心机(美国Thermo Fisher 公司)。 OLYMPUS Ix73 型倒置荧光显微镜(日本 OLYMPUS 公司)。 JY92⁃ⅡN 型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。 Waters alliance 2695 高 效 仪,Waters Quattro Premier XE 质谱仪(美国 Waters公司)。PC12 细胞(未分化型)购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

 RPMI⁃1640 细胞培养基(美国 Hyclone 公司),胎牛血清、青霉素和链霉素(美国 Gibco 公司),多聚⁃L⁃赖氨酸、二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide, DMSO)、TBBPA⁃BHEE( CAS No. 4162⁃45⁃2, 98%)、 ATP、 ADP、 AMP、cAMP(美国 Sigma 公司)。 苯酚、EDTA(分析纯,国药集团化学药剂有限公司)。 甲醇(色谱级,美国J. T. Baker 公司), 、 甲酸 ( 色谱级, 德国Merck 公司)。100 mm 细胞培养皿、细胞刮(美国 Corning 公司), 2 mL 聚乙烯离心管 ( 美国 Axygen 公司),0􀆰 22 μm 聚偏氟乙烯滤器(美国 Millipore 公司)。

100 mm 细胞培养皿用 10 μg / mL 的多聚⁃L⁃赖氨酸包被过夜,弃掉多聚⁃L⁃赖氨酸溶液,用无菌水清洗培养皿,于生物安全柜中吹干。 RPMI⁃1640 细胞培养基中加入 10% (v / v)胎牛血清,100 U / mL 青霉素及 100 μg / mL 链霉素作为完全培养基用于细胞培养。 PC12 细胞以 4 × 106 个/ 皿密度接种于多聚⁃L⁃赖氨酸包被的 100 mm 细胞培养皿中,在 37 ℃、5% (体积分数) CO2 细胞培养箱中培养。 接种24 h 后,完全培养基换为含 2% (v / v)胎牛血清的饥饿培养基,用于细胞暴露实验。

 本实验室之前的研究表明,PC12 细胞暴露于 25 μmol / L 的TBBPA⁃ BHEE 6 h 后,细胞活力在 60% 以上。 其对细胞活力无影响或亚细胞毒性的浓度适合线粒体干扰效应的研究。 本研究将 PC12 细胞暴露于 25 μmol / L 的TBBPA⁃BHEE 中,暴露时间分别为 1、3、6 和 24 h,0􀆰 5% (v / v) DMSO 作为溶剂对照组。 使用倒置荧光显微镜对对照组及 24 h 暴露组的细胞形态进行观察,其他实验组用于 ATP、ADP、AMP 和 cAMP 的测定。 鉴于溶剂对实验结果无显著影响,在实验数据展示时采用溶剂对照组结果,而不再给出空白对照组。

暴露实验结束后,弃掉培养皿中的细胞培养基,用 4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液清洗细胞 2 次。 向每个培养皿中加入 500 μL 4 ℃ 预冷的提取缓冲液(10mmol / L 乙酸铵,4 mmol / L EDTA,苯酚饱和溶液,pH 7􀆰 5),用细胞刮将 PC12 细胞刮下,收集于 2 mL聚乙烯离心管中,整个操作在冰上进行。 将上述细胞提取液超声(工作时间:5 s;间歇时间:15 s;总时间:60 s;超声功率:65 W)。 将超声后的细胞提取液溶液于 15 000 r/ min、4 ℃离心 30 min,取上清液并经 0􀆰 22 μm 滤器过滤得到待测溶液。 另外,每个实验组均设置一个平行处理组,用于暴露实验结束后的细胞计数。

色谱柱:Agilent ZORBAX 300SB⁃C18 色谱柱(150 mm×4􀆰 6 mm, 5 μm,美国 Agilent 公司);流动相:含 0􀆰 1% (v / v)甲酸的 10 mmol / L 乙酸铵溶液(A)和含 0􀆰 1% (v / v)甲酸的甲醇溶液(B)。 梯度洗脱程序:0~5􀆰 0 min, 5% B; 5􀆰 0~16􀆰 0 min, 5% B ~100% B; 16􀆰 0 ~ 21􀆰 0 min, 5% B。 流 速: 0􀆰 8mL / min;柱温:35 ℃;进样量:10 μL。离子源:ESI 源;检测模式:负离子模式;扫描模式:多反应监测模式(MRM mode);源温度:120 ℃;脱溶剂气温度:450 ℃;脱溶剂气流量:800 L / h;锥孔气流量:50 L / min。 各化合物的特征离子对设定如下:ATP m/ z 506􀆰 6 / 159􀆰 2(锥孔电压:30 V;碰撞电压:36 V);ADP m/ z 426􀆰 4 / 134􀆰 1(锥孔电压:30V;碰撞电压:36 V); AMP m/ z 345􀆰 7 / 79􀆰 0(锥孔电压:30 V; 碰 撞 电 压: 30 V)。

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